核酸分離純化的原則
 

　　核酸在細(xì)胞中總是與各種蛋白質(zhì)結(jié)合在一起的。核酸的分離主要是指將核酸與蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等生物大分子物質(zhì)分開。
 

　　在分離核酸時應(yīng)遵循以下原則:保證核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性;排除其他分子污染。 核酸分離與純化的步驟 大多數(shù)核酸分離與純化的方法一般都包括了細(xì)胞裂解、酶處理、核酸與其他生物大分子物質(zhì)分離、核酸純化等幾個主要步驟。每一步驟又可由多種不同的方法單獨或聯(lián)合實現(xiàn)。
 

　　1. 細(xì)胞裂解:核酸必須從細(xì)胞或其他生物物質(zhì)中釋放出來。細(xì)胞裂解可通過機(jī)械作用、化學(xué)作用、酶作用等方法實現(xiàn)。
 

　　(1) 機(jī)械作用:包括低滲裂解、超聲裂解、微波裂解、凍融裂解和顆粒破碎等物理裂解方法。這些方法用機(jī)械力使細(xì)胞破碎,但機(jī)械力也可引起核酸鏈的斷裂,因而不適用于高分子量長鏈核酸的分離。有報道超聲裂解法提取的核酸片段長度從< 500bp ～ > 20kb 之間,而顆粒勻漿法提取的核酸一般< 10kb。
 

　　(2) 化學(xué)作用:在一定的p H 環(huán)境和變性條件下,細(xì)胞破裂,蛋白質(zhì)變性沉淀,核酸被釋放到水相。上述變性條件可通過加熱、加入表面活性劑或強離子劑 而獲得。
 

　　而p H 環(huán)境則由加入的強堿(NaOH) 或緩沖液提供。在一定的p H 環(huán)境下,表面活性劑或強離子劑可使細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)和多糖沉淀,緩沖液中的一些金屬離子螯合劑可螯合對核酸酶活性所必須的金屬離子Mg2+ 、Ca2+ ,從而抑制核酸酶的活性,保護(hù)核酸不被降解。
 

　　(3) 酶作用:主要是通過加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或鏈酶蛋白酶) 以使細(xì)胞破裂,核酸釋放。
 

　　蛋白酶還能降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì),促進(jìn)核酸的分離。其中溶菌酶能催化細(xì)菌細(xì)胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸殘基間的β-(1 ,4) 鍵水解。
 

　　蛋白酶K能催化水解多種多肽鍵，其在65 ℃及有EDTA、尿素(1～4mol/ L) 和去污劑(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在時仍保留酶活性，這有利于提高對高分子量核酸的提取效率。在實際工作中，酶作用、機(jī)械作用、化學(xué)作用經(jīng)常聯(lián)合使用。具體選擇哪種或哪幾種方法可根據(jù)細(xì)胞類型、待分離的核酸類型及后續(xù)實驗?zāi)康膩泶_定。
 

　　2. 酶處理:在核酸提取過程中,可通過加入適當(dāng)?shù)拿甘共恍枰奈镔|(zhì)降解,以利于核酸的分離與純化。如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K 或鏈酶蛋白酶) 可以降解蛋白質(zhì)，滅活核酸酶(DNase 和RNase) ,DNase 和RNase 也用于去除不需要的核酸。
 

　　3. 核酸的分離與純化:核酸的高電荷磷酸骨架使其比蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等其他生物大分子物質(zhì)更具親水性,根據(jù)它們理化性質(zhì)的差異,用選擇性沉淀、層析、密度梯度離心等方法可將核酸分離、純化。