細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒

一，試劑盒組份

二，說明

在研究細胞時經(jīng)常要研究細胞的不同組份，而研究得zui多的兩個細胞組份就是細胞核和細胞漿。分離細胞核蛋白和細胞漿蛋白，不僅可以用于研究蛋白在細胞內(nèi)的定位，而且很多時候分離出來的核蛋白可以用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面的研究，例如EMSA（也稱gelshift），footprinting等。

細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒（Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit）提供了一種比較簡單、方便的從培養(yǎng)細胞或新鮮組織中抽提細胞核蛋白與細胞漿蛋白的方法。約90分鐘就可以完成培養(yǎng)細胞的細胞核蛋白與細胞漿蛋白的分離。抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，報告基因檢測以及酶活力測定等后續(xù)操作。

本試劑盒是通過細胞漿蛋白抽提試劑A和B，在低滲透壓條件下，使細胞充分膨脹，然后破壞細胞膜，釋放出細胞漿蛋白，然后通過離心得到細胞核沉淀。zui后通過高鹽的細胞核蛋白抽提試劑抽提得到細胞核蛋白。

本試劑盒可以抽提50/200個樣品，每個樣品的數(shù)量為約二百萬細胞或約60毫克組織。

三，儲存條件：-20℃保存，一年有效。

四，操作步驟

1. 準備溶液：溫融解試劑盒中的三種試劑，溶解后立即放置在冰上，混勻。取適當量的細胞漿蛋白抽提試劑A備用，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的zui終濃度為1mM。取適當量的細胞核蛋白抽提試劑備用，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的zui終濃度為1mM。
2. 對于貼壁細胞：用PBS洗一遍，用細胞刮子刮下細胞，或用EDTA溶液處理細胞使細胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細胞。離心收集細胞，盡zui大努力吸盡上清，留下細胞沉淀備用。盡量避免用胰酶消化細胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。
3. 對于懸浮細胞：用PBS洗一遍，離心收集細胞，盡zui大努力吸盡上清，留下細胞沉淀備用。
4. 每20微升細胞沉淀加入200微升添加了PMSF的細胞漿蛋白抽提試劑A。（對于二百萬Hela細胞，其細胞沉淀的體積大約為20微升或40毫克。）
5. zui高速劇烈Vortex 5秒，把細胞沉淀*懸浮并分散開。（如果細胞沉淀沒有*懸浮并分散開，可以適當延長vortex時間。）
6. 冰浴10-15分鐘。
7. 加入細胞漿蛋白抽提試劑B 10微升。zui高速劇烈Vortex 5秒，冰浴1分鐘。
8. zui高速劇烈Vortex 5秒，4℃ 12,000-16,000g離心5分鐘。
9. 立即吸取上清至一預冷的塑料管中，即為抽提得到的細胞漿蛋白?？梢粤⒓词褂?，也可以凍存。（千萬不要觸及沉淀，可以在沉淀上方保留極小體積的上清，以免觸及沉淀。）
10. 對于沉淀，*吸盡殘余的上清，加入50微升添加了PMSF的細胞核蛋白抽提試劑。（不吸盡上清會帶來細胞漿蛋白的污染。）
11. zui高速劇烈Vortex 15-30秒，把細胞沉淀*懸浮并分散開。然后放回冰浴中，每隔1-2分鐘再高速劇烈Vortex 15-30秒，共30分鐘。
12. 4℃ 12,000-16,000g離心10分鐘。
13. 立即吸取上清至一預冷的塑料管中，即為抽提得到的細胞核蛋白?？梢粤⒓词褂茫部梢?70℃凍存。
14. 對于新鮮組織：
    A. 把組織盡可能切成非常細小的碎片。按照20:1的比例混合適當量的細胞漿蛋白抽提試劑A和B（例如200微升細胞漿蛋白抽提試劑A中加入10微升抽提試劑B）。并加入PMSF至zui終濃度為1mM配制成組織勻漿液。按照每60mg組織加入200微升組織勻漿液的比例混合組織和組織勻漿液，并在玻璃勻漿器內(nèi)充分勻漿。勻漿需在冰浴或4℃進行。
    B. 勻漿后把勻漿液轉(zhuǎn)移到塑料離心管內(nèi)，冰浴放置15分鐘。
    C. 4℃ 1,500g離心5分鐘。把上清轉(zhuǎn)移至一預冷的塑料管中，為抽提得到的部分細胞漿蛋白。（吸上清時千萬不要觸及沉淀。）
    D. 對于沉淀，到了這一步已經(jīng)充分勻漿，但很多細胞還沒有破碎。接下去按照使用說明的步驟4開始操作，即把沉淀當做已經(jīng)離心收集好的細胞沉淀操作，按照步驟4至步驟13抽提得到細胞漿蛋白和細胞核蛋白。抽提得到的細胞漿蛋白可以和步驟14C中抽提得到的細胞漿蛋白合并。

五，注意事項：

PMSF一定要在抽提試劑加入到樣品中前2-3分鐘內(nèi)加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。

    抽提蛋白的所有步驟都需在冰上或4℃進行。

    本試劑盒對于組織樣品，僅適合于新鮮組織，對凍存過的組織抽提效果很差。

    使用本試劑盒抽提到的細胞核蛋白與細胞漿蛋白均可直接用我們生產(chǎn)的BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。但不適合用Bradford法測定蛋白濃度。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。